Figure 1. Représentation schématique de la double hélice d'ADN.
Les Essentiels 2006, p. 279-293.
© 2006 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
Service de pédiatrie néonatale et réanimation, et Équipe Inserm Avenir, UFR Médecine-Pharmacie, CHU Charles Nicolle, 1, rue de Germont, 76031 Rouen cedex, France
* e-mail : vincent.laudenbach@chu-rouen.fr
Le terme de biologie moléculaire correspond à l'intégration de toutes les données moléculaires nécessaires à la compréhension des mécanismes biologiques. Dans le domaine médical, il désigne essentiellement l'étude des acides nucléiques (ADN, ARN) et de l'ensemble des mécanismes biochimiques autorisant et régulant leur expression sous la forme de protéines fonctionnelles. Ces protéines, mais aussi les lipides, sucres et les acides nucléiques eux-mêmes sont synthétisés et peuvent subir diverses modifications (glycosylation, méthylation, acétylation, hydroxylation, estérification,...) puis sont dégradés, participant ainsi au développement, au fonctionnement cellulaire et à la régénération des tissus. Il est possible, dans le contexte expérimental, de manipuler les séquences d'acides nucléiques afin d'en contrôler l'expression dans des cultures cellulaires ou des organismes entiers (organismes transgéniques), permettant ainsi d'établir, par une approche dite de génétique inverse, un lien entre génome, transcriptome (ensemble des ARN issus du génome), protéome (ensemble des protéines) et phénotype. Par opposition, la génétique conventionnelle consiste à mener une enquête depuis le phénotype vers le génome. Les dernières décades ont vu d'importants progrès dans la compréhension des mécanismes génétiques impliqués dans la sensibilité des individus aux maladies [1] [2] [3] ou dans leur réponse aux médicaments [4] [5] [6] [7], notamment par l'identification de gènes, mutations et polymorphismes génétiques associés à ces maladies. Les avancées du programme de déchiffrage du génome humain, mené de front par des réseaux de laboratoires publics et privés [le Human Genome Project Consortium (http://doegenomes.org) et l'entreprise Celera Genomics® en particulier] fournissent, sous la forme de bases de données, un outil de travail extrêmement puissant. Ces bases de données accessibles au public (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) permettent notamment une évaluation informatique préliminaire de la pertinence d'un projet expérimental (choix du site de mutation d'un récepteur ou d'un canal ionique, par exemple). L'identification de certains réarrangements du génome prédisposant, par exemple, à certains cancers ou influençant leur pronostic peut être réalisée [8] [9]. Dans le domaine de l'infectiologie, la détection d'ADN ou d'ARN exogène est effectuée en routine pour certains agents microbiens par PCR. De nombreux outils sont donc en cours de développement, dont on peut penser qu'ils permettront à l'avenir de porter des diagnostics actuellement difficiles (myopathies), de mieux définir les patients à risque (sensibilité à l'hyperthermie maligne [10] [11] [12], déficits en butyrylcholinestérase [6]) et d'optimiser leur prise en charge thérapeutique.
L'information génétique nécessaire à la vie est toujours présente sous la même forme chimique : l'acide désoxyrionucléique (ADN double brin, molécule linéaire organisée dans l'espace sous la forme d'une double hélice (figure 1). Cette chaîne polymérique est constituée de 4 types de monomères, appelés nucléotides. Chaque nucléotide comporte un sucre (le désoxyribose), doté d'un groupement phosphate (P) en position 5' et d'un groupement hydroxyle (OH) en position 3'. Chaque sucre est lié au voisin, les groupement phosphate et hydroxyle réalisant une liaison phosphodiester. Il en résulte une répétition sucre-phosphate qui constitue littéralement la colonne vertébrale de l'ADN. Celle-ci porte sur toute sa longueur une série de bases, liées aux sucres. Il s'agit de bases puriques (adénine (A) ou guanine (G)) ou pyrimidiques (cytosine (C) ou thymine (T)). Chaque brin d'ADN a une orientation déterminée par un groupement 5' phosphate libre à une extrémité et un groupement 3' OH libre à l'autre. Les deux brins d'une molécules d'ADN sont antiparallèles (orientés en sens contraire). Leur association (hybridation) est due à l'établissement de liaison hydrogène entre leurs bases. Ces liaisons sont faibles : leur rupture (déshybridation, dénaturation) peut être obtenue par simple augmentation de température. D'un brin à l'autre, une Guanine ne peut être appariée en vis-à-vis qu'à une Cytosine, tandis qu'une Adénine ne peut être appariée qu'à une Thymine (figure 1) [13].
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La duplication du matériel génétique lors d'une mitose repose sur un mécanisme appelé réplication. La synthèse d'un néo-brin d'ADN se fait à partir d'une matrice constituée par une molécule d'ADN monobrin après déshybridation d'un ADN double brin. Cette synthèse est initiée à partir de courts brins appelés amorces, par des enzymes appelées ADN polymérases, capables de créer des liaisons phosphodiester entre des nucléotides libres. Elle obéit à la loi de la complémentarité adénine-thymine et guanine-cytosine. Le brin d'ADN néo-synthétisé, associé au brin d'ADN matrice, constitue alors une structure d'ADN double brin réalisant une copie de la molécule initiale (figure 2) [13].
Un gène est défini comme une séquence d'ADN codant une ou plusieurs protéines apparentées. L'ensemble des informations codantes contenues dans un organisme est appelé génome. Les mécanismes contrôlant l'expression de l'information contenue dans le génome sont très conservés parmi les espèces vivantes. La première grande étape de ce processus est un autre type de polymérisation, la transcription. Certains segments de l'ADN génomique servent de matrice pour la synthèse, non plus d'ADN, mais d'un acide nucléique apparenté, l'ARN. Cette synthèse est effectuée dans le noyau de la cellule par les ARN polymérases. L'ARN diffère de l'ADN par sa composition en ribose (au lieu du désoxyribose) et par le remplacement d'une des bases, la Thymine, par une Uracile. Les trois autres bases (A, G, C) sont identiques. Une même matrice d'ADN permet la synthèse de plusieurs molécules d'ARN identiques. La présence d'un promoteur, région contenant notamment la séquence TATA, sur laquelle se fixe le complexe moléculaire de l'ARN polymérase, détermine lequel des deux brins de l'ADN est transcrit. La fonction du promoteur est, non seulement, de permettre l'initiation de la transcription, mais également de permettre l'interaction de l'ARN polymérase avec différents facteurs, dits transcriptionnels, régulant de façon positive ou négative la transcription du gène. Ainsi, au lieu d'exprimer l'ensemble de son répertoire génomique au plus haut niveau en permanence, chaque cellule ajuste le niveau d'expression de ses différents composants via la régulation transcriptionnelle en fonction de signaux divers (facteurs de croissance, cytokines, protéines régulatrices du cycle cellulaire...), capables d'influer sur le recrutement et l'activation des facteurs transcriptionnels.
Les étapes faisant suite à la transcription d'ADN en ARN sont également la cible de mécanismes régulateurs. Les ARNm, issus de la transcription des gènes, subissent une maturation appelée épissage (splicing) au cours duquel des éléments d'ADN non codant (introns) sont éliminés et des éléments codants (exons) conservés. L'ARNm mature est alors transloqué du noyau vers le cytoplasme où il est traduit en protéine. L'épissage peut aboutir à diverses combinaisons d'exons (splicing alternatif), permettant la production, à partir d'un même ARNm, de différentes protéines. Par exemple, la calcitonine, hormone hypocalcémiante et le CGRP, Calcitonin Gene Related Peptide, neuromodulateur, sont produits à partir du même gène. Au-delà de l'épissage, d'autres mécanismes régulateurs interviennent, modulant la stabilité de l'ARNm. Cela peut, par exemple, se traduire par la constitution de « stocks » d'ARNm permettant l'expression rapide d'une protéine en réponse à un signal. Inversement, le processus de Post Transcriptional Gene Silencing (PTGS, inhibition post-transcriptionnelle), identifié récemment, est basé sur l'intervention de molécules d'ARN double-brin (Double Stranded RNA, dsRNA), clivées en courtes molécules, les ARN interférents (Short Interfering RNA, siRNA) [14]. Ces siRNA sont spécifiques d'un gène et peuvent réguler négativement son expression de différentes manières : dégradation de l'ARNm par un effet catalytique sur des enzymes de type RNAse, interférence avec les mécanismes de la transcription et de l'épissage, méthylation des guanines (inhibant la transcription) [14].
L'unité codante de base de l'ADN (et, donc, de l'ARNm) est le codon. Il s'agit d'un triplet de nucléotides correspondant à un acide aminé (sauf dans le cas des codons stop, auxquels aucun acide aminé ne correspond et qui marquent donc la fin de la traduction d'un ARNm). Les protéines sont synthétisées par assemblage, selon des combinaisons variables, de 20 acides aminés différents, en fonction d'un répertoire codon/acide aminé conservé au sein de toutes les espèces. Chaque codon ne code que pour un et un seul acide aminé. Ainsi est défini le code génétique (tableau I). Dans la mesure ou il existe 4 bases, les codons, constitués de 3 nucléotides, sont au nombre de 43 soit 64. Le code génétique est dit dégénéré, c'est-à-dire que plusieurs codons peuvent coder pour le même acide aminé. Cette « dégénérescence » permet, en fait, qu'une mutation ponctuelle (par exemple, à l'occasion d'une erreur de réplication) n'ait aucune conséquence en termes de traduction protéique (mutation dite isosémantique).
Le processus de traduction de l'ARNm en protéine est mené par le ribosome, complexe moléculaire associant des ARN constitutifs (ARN ribosomaux) et des protéines. Pour mener à bien la traduction, le ribosome fait appel à des ARN dits de transfert (ARNt), dont chacun correspond à un acide aminé. Une extrémité de l'ARNt est porteuse d'un acide aminé spécifique, tandis que l'autre extrémité comporte une séquence de 3 nucléotides (anticodon) complémentaire de celle portée par l'ARNm. Une succession d'ARNt porteurs des acides aminés correspondants est ainsi recrutée par le ribosome au fur et à mesure de la « lecture » de l'ARNm [13].
À l'aide de méthodes chimiques, la séquence d'un ADN peut être déchiffrée. En 1995, le génome de la bactérie Haemophilus influenzae fut la première séquence complète d'un organisme vivant publiée [15]. Depuis lors, le génome de plus de 100 organismes et les cartes génétiques de plusieurs organismes pluricellulaires ont été rendus publics. Les résultats de la séquence du génome humain ont été publiés simultanément en 2001, puis précisés en 2003, par les équipes du Human Genome Project Consortium et par la société Celera Genomics® [16] [17]. Leurs résultats respectifs ont abouti à une réévaluation du nombre de gènes constituant le génome humain, estimé actuellement aux alentours de 25 000 (alors que, jusqu'alors, on tablait sur environ 70 000). Compte tenu des multiples étapes de maturation post-transcriptionnelle, traductionnelle et post-traductionnelle, une même molécule d'ADN peut être à l'origine de la synthèse de nombreuses protéines apparentées. Les estimations actuelles évaluent à environ 500 000 le nombre de protéines différentes synthétisées par l'organisme humain, dont environ 20 % seraient susceptibles d'être simultanément exprimées au sein de chacune des 1013 cellules qui nous composent.
Lors de la réplication de l'ADN, des erreurs aléatoires surviennent constamment. Des signaux environnementaux (radiations ionisantes ou solaires, toxiques mutagènes...) peuvent également altérer l'ADN. Divers mécanismes de réparation endogènes permettent le maintien de la stabilité globale du génome. Lorsqu'une variation d'un nucléotide n'est pas corrigée et est retrouvée chez moins de 1 % de la population d'une espèce, on parle de mutation. Dans la plupart des cas, ces mutations n'ont en fait aucune conséquence (mutations isosémantiques ou concernant des régions de l'ADN peu actives à notre stade de l'évolution). Dans de rares cas, la mutation va permettre à l'individu de mieux exploiter son environnement, lui procurant un avantage sélectif. Elle sera alors transmise à la descendance. Dans certains cas, en revanche, elle altérera de façon déterminante une séquence nécessaire à l'expression d'une protéine, entraînant une altération de la nature ou un déficit en une protéine. Des variations de ce type participent à la sélection et à l'évolution des espèces. Les régions du génome ont une variabilité différente. Une séquence d'ADN non codante, non impliquée dans un processus de régulation, aura une variabilité relativement importante et sera facilement répercutée sur les générations suivantes, car non soumise à une pression de sélection. Au contraire, une séquence d'ADN codant pour une protéine essentielle sera moins facilement transmise, puisque aboutissant à une altération d'une protéine éventuellement responsable d'un désavantage sélectif. Lorsqu'une variation stable du génome (variation d'un nucléotide, répétition successive d'une séquence particulière...) est observée chez plus de 1 % de la population, on ne parle plus de mutation mais de polymorphisme [13].
Au cours de l'évolution, des variations sont donc apparues dans le génome des espèces animales et végétales (mutations, duplication, recombinaisons ou segment shuffling (« glissement » de segments d'ADN) aboutissant à des gènes hybrides...). Ces variations ont parfois été transmises de cellule à cellule voire d'espèce à espèce (infection d'un organisme, croisements entre espèces). Il existe donc entre un grand nombre de parentés entre les séquences des différents génomes, parentés que les bases de données et outils informatiques actuels permettent d'analyser. Il est ainsi possible, dans certains cas, de spéculer sur la fonction d'une protéine dans une espèce donnée en analysant la séquence du gène correspondant ou sa composition en acides aminés, comparée avec celle d'une protéine homologue connue dans une autre espèce.
De plus, les variations du génome telles que les polymorphismes portant sur un seul nucléotide (single nucleotide polymorphisms, SNP) peuvent être utilisés pour des études de liaison génétique. Lorsque deux SNP, considérés comme des allèles, sont suffisamment proches l'un de l'autre sur le chromosome, ils vont tendre à coségréger lors de la recombinaison précédant la méïose. Ils définissent alors un haplotype. On dit d'eux qu'ils sont génétiquement liés. Lorsque la fréquence d'un haplotype dans une famille ou une population donnée (par exemple, plus sensible à une maladie) excède celle prédite par la combinaison des fréquences individuelles des différents allèles/SNP, cela suggère qu'il existe un déséquilibre de liaison au sein de cette population et que le site d'altération du génome à l'origine de la maladie est proche du locus porteur de cet haplotype. Le consortium SNP (http://snp.cshl.org/, accès 22/05/2006) a caractérisé près de 1,8 · 106 SNPs, parmi lesquels 30 000 à 500 000 pourraient potentiellement être employés dans le cadre de l'analyse de maladies génétiques [18] [19].
En laboratoire, des éléments du génome peuvent être « manipulés » à l'aide d'enzymes, telles que des endonucléases coupant l'ADN, des ligases liant les brins d'ADN ou des polymérases synthétisant de nouvelles chaînes d'acides nucléiques. Ces outils permettent la réalisation de mutations, délétions, recombinaisons, clonages (insertion d'une séquence dans un vecteur, bactérien par exemple, autorisant sa multiplication et sa conservation) ou de diverses constructions artificielles. Ces constructions peuvent ensuite être introduites dans des vecteurs dits d'expression, afin de permettre la production de la (ou des) protéine(s) correspondante(s). Ainsi, l'expression d'une protéine permet souvent de préciser la fonction d'un gène étudié. Pour autant, l'approche in vitro peut être insuffisante pour déterminer le rôle exact du gène d'intérêt, notamment en raison de modifications post-traductionnelles difficiles à reproduire alors qu'elles jouent un rôle critique dans un organisme entier. C'est une des justifications de la transgenèse, qui correspond à l'introduction d'une mutation dans le génome d'un organisme animal ou végétal, à un stade ultra-précoce du développement (blastocyste). Cette mutation peut aboutir à la surexpression d'une forme normale (ou anormale, selon le but de l'expérience) de la protéine ou, au contraire, à sa suppression (invalidation génique, animaux knock-outs). Cette modification du génome peut, selon la construction réalisée, concerner l'ensemble de l'organisme ou seulement certains de ses tissus (knock-outs conditionnels). Elle peut même être induite chez l'animal adulte, à l'aide de promoteurs et systèmes de recombinaison sensibles, par exemple, à la tétracycline. Cette transgenèse « inductible » est particulièrement utile pour analyser les gènes dont la modification précoce n'est pas compatible avec un développement viable. On peut également introduire la construction dans une partie d'une organisme entier à l'aide d'un vecteur d'expression (injection de plasmide, transfection « balistique » sur particules d'or ou infection par des virus recombinants, par exemple). On sait enfin, depuis peu, réduire le niveau d'expression d'un gène à l'aide du phénomène d'« interférence de l'ARN », basé sur l'application de siRNA correspondant au gène cible. La simplicité de la synthèse de ces siRNA offre des perspectives extrêmement riches. L'approche consistant à transfecter des siRNA dans des cellules cultivées in vitro est techniquement beaucoup moins lourde que la transgenèse. Elle permet, de plus, de titrer l'effet inhibiteur que l'on souhaite exercer sur le gène cible en utilisant des concentrations plus ou moins élevées de siRNA. En revanche, l'utilisation directe in vivo de ces siRNA se heurte encore, à ce jour, à des limites méthodologiques [14] [20].
Cette technique permet d'obtenir, à partir de quantités très faibles (de l'ordre de 1 000 molécules), plusieurs microgrammes d'ADN. Elle consiste à choisir des amorces nucléotidiques synthétiques capables de s'hybrider aux bornes de la séquence cible (matrice), puis à amplifier cette dernière par une succession de cycles dénaturation-hybridation des amorces-élongation des brins complémentaires par une polymérase (figure 3). Il en résulte une augmentation de la quantité d'ADN quasi-exponentielle (en fait, le rendement de la réaction de polymérisation diminue progressivement avec le nombre de cycles par épuisement progressif des composants). Elle nécessite un thermocycleur, permettant des variations rapides et contrôlées de la température de l'échantillon : 94 oC pour la dénaturation, une température d'hybridation variable, par exemple 60 oC, puis une élongation à 72 oC, température de fonctionnement optimal de la polymérase employée. Cette dernière, la Taq polymérase, peut résister à ces changements de température et synthétiser l'ADN à grande vitesse (actuellement, de l'ordre de 1 000 nucléotides par seconde). Si l'on part d'un échantillon d'ARN, une étape de rétrotranscription par une transcriptase inverse permet d'obtenir la matrice correspondante sous forme d'ADNc (Reverse Transcriptase-PCR, RT-PCR). Enfin, l'utilisation de fluorophores type Cybergreen® (intercalant de l'ADN double brin) permet de suivre la production d'ADN en temps réel et d'en déduire, à partir de la pente de la courbe, la quantité de matrice initiale (Real Time Quantitative PCR, PCR quantitative en temps réel).
La PCR est utilisée depuis de nombreuses années pour détecter des agents infectieux tels que le virus HIV ou la bactérie Bordetella Pertussis, responsable de la coqueluche. Actuellement, pratiquement tout agent infectieux peut être détecté à l'aide de techniques dérivées. L'utilisation comme matrice de l'ARN ribosomal 16S, très conservé parmi les différentes bactéries, permet d'amplifier à peu près n'importe quel génome bactérien qui, après séquençage et comparaison aux banques de données informatiques, peut alors être identifié [21].
L'expression d'une gamme de gènes peut être analysée simultanément par la technique des « biopuces ». Il s'agit de lamelles de verre sur lesquelles sont disposés, sous forme de points (spots), un large éventail de courts fragments d'ADN monobrin. Les ARNm extraits de cellules ou tissus exposés à une condition, pathologie ou traitement pharmacologique sont rétrotranscrits en ADNc monobrin. Au cours du processus de rétrotranscription, les fragments d'ADNc sont marqués par un composé fluorescent. Le produit de rétrotranscription est ensuite mis en contact avec la biopuce. Au niveau de chaque spot, l'intensité du signal fluorescent sera donc proportionnelle à la quantité d'ARNm initiale, c'est-à-dire au niveau d'expression du gène correspondant. On peut ainsi analyser simultanément les variations d'expression d'un nombre de gènes allant jusqu'à 10 000 sur une même puce. Dans le domaine de la cancérologie, par exemple, le profil d'expression de marqueurs possédant une valeur pronostique peut ainsi être analysé sur tissu tumoral mammaire [22].
Ce champ d'investigation connaît actuellement un développement important. Nous nous limiterons ici à la description de quelques exemples. Quatre espèces, dont les génomes sont entièrement séquencés, sont plus particulièrement employées en conditions expérimentales : la levure Saccharomyces cervisiae, le nématode Caenorhabditis Elegans, la mouche Drosophila Melanogaster et la souris Mus Musculus. D'importantes avancées ont également été obtenues chez l'humain.
Les anesthésiques volatils halogénés (AVH) inhibent la prolifération de cette levure de façon concentration-dépendante [23]. La mutation de la protéine transmembranaire ZZZ4 permet à la levure de résister à cette inhibition. ZZZ4 est un homologue de la PLAP (phospholipase A2-activating protein), impliquée dans divers signaux de transduction intracellulaire, ainsi que dans la dégradation des protéines ubiquitinylées. L'ubiquitine est une petite protéine dont la fonction est de marquer les protéines destinées à être dégradées. La mutation de deux autres gènes de cette levure modifie sa sensibilité aux AVH : le premier code pour une protéine liant l'ubiquitine ligase (la protéine ZZZ1/BUL1), l'autre pour l'ubiquitine ligase elle-même. De plus, les mutants du protéasome pre1 et pre2, dont la fonction protéolytique est réduite, sont également plus résistants à l'effet inhibiteur des AVH. Globalement, ces résultats suggèrent que la dégradation de protéines ubiquitinylées (par exemple, des canaux ioniques ou des protéines d'adhésion impliquées dans la libération de vésicules de neurotransmetteurs) ou les altérations de la signalisation subcellulaire par la phospholipase A2 pourraient intervenir dans les effets des AVH [23].
C. elegans est un modèle expérimental quasi-parfait : son cycle vital n'est que de quelques jours, son schéma corporel est particulièrement simple (959 cellules exactement, dont 102 neurones) et il résiste à la congélation. Un grand nombre de mutants de ce nématode sont actuellement disponibles. Deux critères de jugement sont employés pour analyser l'effet des AVH sur cet organisme : a) l'obtention d'une immobilité après 10 secondes d'exposition ; b) la rapidité de la dispersion à partir du centre d'une plaque d'agarose à la périphérie de laquelle se trouve de la nourriture. Ces deux paramètres sont altérés de façon concentration-dépendante par les AVH. La mutation de la protéine unc-79 entraîne une hypersensibilité aux AVH. Inversement, les mutations des gènes unc-8, codant pour une famille de canaux sodiques, et unc-1 codant pour un homologue de la protéine humaine stomatine, impliquée dans le contrôle des flux transmembranaires des ions Na+ et K+, corrigent les effets de la mutation unc 79. La stomatine est une protéine constitutive des « radeaux lipidiques », microdomaines de la membrane plasmique dotés de mobilité et assemblant entre eux divers complexes protéiques transmembranaires. Ces complexes peuvent comporter des cibles potentielles pour des AVH (récepteurs-canaux, par exemple). D'autres mutations conférant une diminution de la sensibilité aux AVH ont été identifiées. C'est le cas de celle de la syntaxine, un membre du complexe protéique SNARE, impliqué dans la fusion des vésicules de neurotransmetteurs avec la membrane plasmique précédant la libération de leur contenu dans la fente synaptique [23].
D. melanogaster est utilisée en génétique depuis plus de 80 ans. Dans cette espèce également, un nombre important de mutants est disponible. Le screening systématique de ces mutants en terme de sensibilité aux agents anesthésiques a permis d'identifier 4 mutations dites har (halothane-resistant). Au niveau de la jonction neuromusculaire larvaire, l'halothane diminue les mini-courants excitateurs induits par le glutamate chez les insectes sauvages, mais pas chez les mutants har 38 et har 85 [24]. D'autre part, l'invalidation des gènes Brown et White diminue également la sensibilité à l'enflurane [25]. Les gènes Brown et White codent pour des protéines membranaires impliquées dans la capture de la guanine, nécessaire à la synthèse de GMP cyclique, lequel participe au fonctionnement de plusieurs systèmes de neurotransmission. Ce type de résultat apporte des éléments permettant de littéralement « disséquer » le mode d'action des AVH. Toutefois, il reste souvent difficile de distinguer le cas où l'agent testé agit directement sur la cible supposée de celui où il affecte, en fait, un élément situé en amont ou en aval dans la chaîne d'événements conduisant à l'effet anesthésique final.
Plusieurs souches de souris dites « sauvages » (par opposition aux mutantes) ont des sensibilités variables aux anesthésiques. La souche LS (pour long sleep) est très sensible à l'éthanol et aux AVH par comparaison avec la souche SS (short sleep). Il existe au moins 9 loci variables entre LS et SS. Des souches mutantes, présentant des sensibilités variables à l'éthanol et aux benzodiazépines, ont également été produites par recombinaison homologue. Par exemple, les animaux mutés au niveau de la sous-unité 
3 du récepteur GABAA (3-/-) sont résistants aux anesthésiques volatils par comparaison avec les contrôles 3+/+ [23].
Morgan et al. [27] ont identifié une population de patients ayant des altérations de la fonction mitochondriale, dont l'étude du tracé EEG a révélé une grande sensibilité au sévoflurane [26]. Cela est cohérent avec les observations faites chez C. elegans, chez qui les mutations du gène gas-1, qui code pour une des sous-unités du complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale, entraîne également une grande sensibilité aux AVH testés.
Lorsqu'une maladie génétique est directement liée à une modification d'une protéine, l'établissement d'un lien direct entre la mutation et le phénotype peut être relativement aisé (exemple de la drépanocytose due à une modification d'un seul acide aminé au niveau de la chaîne de la globine). Il est beaucoup plus difficile d'établir la contribution du patrimoine génétique à des maladies répandues (cancers, maladies cardiovasculaires, sensibilité au sepsis) ou encore à la réponse pharmacodynamique à une drogue. Les SNP (cf. supra.) peuvent être employés pour effectuer des études de liaison génétique dans ce contexte. Parmi les 1,8 · 106 SNP cartographiés, seuls 60 000 sont localisés dans des régions codantes (exons), dont une minorité entraîne un changement d'acide aminé au niveau de la protéine correspondante. Les autres peuvent appartenir à des régions régulatrices. L'influence de ces variations génétiques sur une maladie peut être très discrète ou influencée par des facteurs environnementaux. L'analyse d'un grand nombre de patients est alors nécessaire pour dégager une liaison génétique avec la maladie [18] [19]. Par exemple, une étude multicentrique a été nécessaire pour démontrer que les patients présentant l'allèle TNF2 G308A dans le promoteur du gène TNF
produisaient davantage de TNF et avaient une mortalité accrue en situation de choc septique par comparaison avec une population contrôle [3]. Ce type de polymorphisme peut également influencer la réactivité vasculaire : il a été montré que la réponse vasculaire à une stimulation 1-adrénergique par la phényléphrine était augmentée chez les individus ayant le polymorphisme G894T du gène de la NO synthase endothéliale [28].
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Moindre conversion en morphine, moindre efficacité (mais autant d'effets secondaires) |
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On estime que plus de deux millions de patients hospitalisés chaque année aux États-Unis présentent une réaction adverse sévère à un médicament. Une des façons d'éviter ce type d'accident serait de réduire les doses de médicament chez les patients qui, en raison de leur patrimoine génétique, ont de faibles capacités de métabolisation ou de développer des drogues dont le métabolisme éviterait la voie affectée par tel ou tel polymorphisme. Dans une revue systématique, des auteurs ont identifié 27 médicaments impliqués dans des effets indésirables fréquents, dont 59 % étaient métabolisés par une enzyme codée par un gène dont on connaissait au moins un allèle associé à une faible capacité de métabolisation [29]. Pour ce qui concerne l'anesthésie-réanimation, le tableau II indique quelques exemples de lien entre mutation ou polymorphisme génétique et sensibilité variable à une médicament [4].
Nous disposons d'un nombre croissant d'informations sur les bases génétiques des interactions moléculaires permettant le fonctionnement des cellules et êtres vivants. Toutefois, nous n'en sommes qu'au début du déchiffrage de processus infiniment complexes et les efforts de recherche à fournir restent extrêmement importants. Nous n'en sommes pas encore au stade de maîtrise technique décrit dans le film de science-fiction « Welcome to Gattaca » (Andrew Niccol, 1997), dans lequel un dépistage néonatal sur une goutte de sang permet de déterminer immédiatement la probabilité qu'à l'individu de développer un jour un cancer ou une maladie cardiovasculaire ! En ce qui concerne l'anesthésie, les évidences expérimentales obtenues nous confirment que l'idée d'une cible unique expliquant les effets des agents employés n'est pas vraisemblable. Sur le plan clinique, les méthodes de biologie moléculaire vont sans doute nous aider, à l'avenir, à définir certains profils à risque de manière moins invasive qu'actuellement (sensibilité à l'hyperthermie maligne) [30]. Elles nous permettront peut-être un jour de connaître la sensibilité du patient que nous devons endormir à telle ou telle drogue. Pour l'instant, la détermination du profil des SNP de chaque patient dans le but d'identifier, par exemple, les patients à haut risque de mortalité susceptibles de bénéficier davantage d'une thérapeutique donnée, se heurte à un problème de temps, de disponibilité des méthodes et de coût : tester 100 000 SNP chez un patient coûte environ 1 million de dollars. Enfin, les aspects éthiques résultants de l'identification de marqueurs suggérant une mortalité accrue devront être pris en compte et donneront vraisemblablement lieu à une réflexion spécifique lorsque la quantité de données et leur possibilité d'utilisation en routine le justifieront. Il est également important de rappeler qu'à l'heure actuelle, en raison de difficultés techniques non maîtrisées, de l'absence de démonstration d'une meilleure efficacité et d'une moindre nocivité, les approches de type thérapies géniques ne l'emportent pas encore sur l'approche pharmacologique, dans aucun des domaines médicaux explorés.
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Phe
Ser
Ile 
